Тревните скариди са важен икономически вид в китайската индустрия за аквакултура в Китай. През последните години обачеХепатопанкреатен микроспоридий(EHP), паразит, заразяващ хепатопанкреаса на скаридите, силно се отрази на индустрията. Тъй като понастоящем няма ефективно лекарство или ваксина за лечение на това заболяване, бързото и точно откриване е от решаващо значение за предотвратяване на разпространението му.
A.magnified 9. 0 × 1 0 3 пъти; Б. увеличен 5.0 × 104 пъти.
Qiao yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Изолиране и морфологично наблюдение на хепатопанкреатичен микроспоридий в Litopenaeus vannamei. Списание за риболовни науки на Китай, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Откриването на EHP разчита предимно на методите на молекулярна биология, като PCR технологията е най -често срещаната. Въпреки че PCR предлага висока чувствителност, той изисква скъпо PCR оборудване и специализирана лабораторна среда, което го прави неподходящ за използване на полето. За да се справи с този проблем, изследователският екип разработи два метода за бързо откриване, базирани на технологията MIRA. Тези методи предлагат висока чувствителност, бърза реакция и лесна работа, което позволява ефективно и бързо откриване на EHP на място на място, без да е необходимо сложно лабораторно оборудване, като по този начин се запълва празнината в текущите методи за откриване.
Амплификационни реагенти, използвани в проучването:
- ДНК изотермичен комплект за бързо усилване (основен)
- ДНК изотермичен комплект за бързо усилване (колоиден златен тип лента)
Технологията Mira е мултинзимен изотермичен метод за усилване на бързото усилване на нуклеиновата киселина. Основният му принцип включва координираното действие на множество функционални протеини при температури на околната среда за постигане на бързо усилване на нуклеиновата киселина, което позволява наистина преносимо откриване на нуклеинова киселина на място.
Методи на изследване
Извличане на пробата
Изследователският екип събра както заразени, така и здрави проби от тревни скариди от три ферми за скариди в провинция Liaoning, извличайки ДНК от хепатопанкреаса на скаридите.
Дизайн на грунд
Три комплекта MIRA праймери са проектирани, насочени към ген на S8 серин протеин на EHP (номер на присъединяване към GenBank: на 182063). Този ген има уникални активни сайтове, гарантирайки спецификата на откриването.
Откриване на Mira-Ege и Mira-LFD
А) Оптимизирани температури на реакцията на RPA-епоха. М: DL 500 маркер; N: отрицателен контрол; Щамове 1-5: 25 градуса, 30 градуса, 37 градуса, 39 градуса и 42 градуса.
(B) Оптимизирани времена за реакция на RPA-епоха. М: DL 500 маркер; N: отрицателен контрол; 1: 10 мин; 2: 20 мин; 3: 30 мин.; 4: 40 мин.
В) Оптимизирани температури на реакцията на RPA-LFD. N: отрицателен контрол; 1: 25 градуса; 2: 30 градуса; 3: 37 градуса; 4: 39 градуса; 5: 42 градуса.
(D) Оптимизирани времена за реакция на RPA-LFD. N: отрицателен контрол; 1: 5 мин; 2: 10 мин; 3: 20 мин.
Двата метода за откриване на MIRA, MIRA-AGE (електрофореза на агарозен гел) и Mira-LFD (колоиден златен страничен поток имуноанализ), бяха използвани за откриване на EHP. Изследователският екип оптимизира температурите на реакцията и пъти чрез експериментиране. MIRA-AGE амплифицира целевата ДНК за 30 минути при 37 градуса, докато Mira-LFD завърши усилването само за 10 минути при 37 градуса, като резултатите могат да бъдат четени в рамките на 5 минути.
Експериментални резултати
Специфичност и чувствителност
А) Специфичност на откриването на RPA-епоха. М: DL 1000 маркер; П: Носема Бомбисис; 1: EHP; 2: енцефалитозон; 3: Микроспоридия; 4: Синдром на бяло петно; 6: ненормален; N: Отрицателен контрол.
(Б) Специфичност на откриването на RPA-LFD. П: Носема Бомбисис; N: отрицателен контрол; 1: EHP; 2: енцефалитозон; 3: Микроспоридия; 4: Синдром на бяло петно; 6: Ненормален.
(C) Чувствителност на RPA-епоха с градиентни разреждания на рекомбинантни плазмиди. М: DL 500 маркер; N: отрицателен контрол; 1: 4.7 × 10^5 копия/µl; 2: 4.7 × 10^4 копия/µl; 3: 4.7 × 10^3 копия/µl; 4: 4.7 × 10^2 копия/µl; 5: 4.7 копия/µL; 6: 4.7 копия/µl.
(D) Чувствителност на RPA-LFD с градиентни разреждания на рекомбинантни плазмиди. N: отрицателен контрол; 1: 4.7 × 10^5 копия/µl; 2: 4.7 × 10^4 копия/µl; 3: 4.7 × 10^3 копия/µl; 4: 4.7 × 10^2 копия/µl; 5: 4.7 копия/µL; и 6: 4.7 копия/µl.
Експериментите демонстрираха, че технологията MIRA има висока специфичност, точно открива EHP, без да реагира на други патогени. По отношение на чувствителността и двата метода имат граница на откриване от 4,7 копия/µL, значително по -висока от чувствителността на традиционния PCR.
Тест за клинична проба
Резултатите от тестване на 30 клинични проби показват, че Mira-Age и Mira-LFD имат процент на положителност от 70%, малко по-нисък от 80%на QPCR, но значително по-високи от традиционните 56,7%на PCR на PCR.
Перспективи за кандидатстване
Методите на откриване на базата на MIRA позволяват бързо усилване на целевите гени при постоянни температури. По-специално, методът MIRA-LFD може да даде резултати само за 10 минути, без да е необходимо сложно лабораторно оборудване, което го прави идеален за използване на място в фермите за скариди. Високата чувствителност и специфичност на тази технология го правят ефективен инструмент за ранно откриване и контрол на EHP, като по този начин защитават здравето и развитието на индустрията за земеделие на тревни скариди.
Сред тези методи колоидният имуноанализ на страничния поток на злато (Mira-LFD) е особено подходящ за приложения на място поради неговата простота и интуитивни резултати. Земеделските стопани на тревни скариди могат да открият и реагират бързо на инфекции с ЕХП, подобрявайки възможностите за контрол на заболяванията, значително повишават ефективността на земеделието и намаляват икономическите загуби.