《Развитие на нов Cas13a/Cas12a-медииран"Едноколен" Двоен Анализ за откриване на генетично модифицирани култури експрес
Генетично модифицираните култури са широко засадени по целия свят и много страни постепенно подобряват своите регулаторни мерки, за да гарантират безопасността на генетично модифицираните култури. Разработването на бързи и точни методи за генетично откриване на място е много важно за селското стопанство и биобезопасността и може да облекчи обществените опасения относно генетично модифицираните продукти.
В това проучване изследователската група разработи нова реакция с един съд -- Mira Dual Detection, комбинирано с Dual CRISPR (MR-DCA метод) за едновременно откриване на CAMV35s и NOS генетични цели в генетично модифицирани култури, осигурявайки прост и ефективен метод за откриване за откриване на генетично модифицирани култури.
Експериментални методи
Двойният продукт Mira се анализира от Cas13a и Cas12a Dual System за генериране на два независими сигнала, които не пречат един на друг, а след това флуоресцентният цвят се чете чрез инструмент за осветяване или от тестова лента с две Т линии за постигане на двойно-канален отчитане. Целият процес е завършен за по -малко от 35 минути, с ограничение за откриване до 20 копия.
(Принцип на MR-DCA откриване на CAMV35s и NOS)
Целият експеримент е разделен на три стъпки: усилване на MIRA, реакция на CRISPR и два метода за интерпретация на резултата.
Генът CAMV35S се използва като цел на Cas13a, а NOS генът се използва като цел на Cas12a. Две двойки мира праймери са проектирани съответно. Системата CAS13A разпознава само РНК, така че е проектиран предния праймер, който съдържа Т7 промотор за последваща транскрипция и активиране на CAS13a. Към гена NOS се добавя PAM. Горните добавки гарантират, че както Cas13a, така и Cas12a протеините могат да се свържат със съответните им CRRNA и няма намеса или кръстосана реакция между двете системи.
Експериментална ситуация
Чувствителност и специфичност
Пробата се разрежда в градиент за тестване на интензитета на флуоресценция на реакцията на MIRA. Установено е, че интензитетът на флуоресценция все още може да бъде открит при концентрация на пробата 20 μL. Концентрацията от 20 μl е най -накрая избрана за експеримента.
(Различни концентрации на пробата и тестови ленти се използват за развитие на цвета и изчисляване на количественото определяне на интензивността)
За допълнителна оценка на специфичността на MR-DCA, изследователският екип тества смесени проби от не-трансгенни животни и не-трансгенни растения. Резултатите показват, че само трансгенни проби, съдържащи CAMV35s и NOS, имат високо флуоресцентни сигнали, докато интензивността на флуоресценция на други проби е близка до тази на отрицателната контрола. MR-DCA може да се използва като специфична платформа за откриване на нуклеинова киселина с двойна цел.
24 проби от култури бяха тествани от MR-DCA. Сред тях 1, 2, 15, 16, 21 и 22 са трансгенна царевица, съдържаща промотор CAMV35S. 7, 8, 23 и 24 са устойчив на болести трансгенен ориз, съдържащ Terminator NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 и 18 са трансгенни соя, съдържащи промотор на CAMV35S и NOS Terminator.
(Резултати от теста на 24 проби)
Бърза реакция
Времето за реакция е важен фактор за откриване на място. Изследователският екип забеляза, че флуоресцентните сигнали на FAM и HEX могат да бъдат открити чрез флуоресцентен инструмент, когато времето на реакция е 10 минути. MIRA в комбинация с реакция на CRISPR също наблюдава жълта флуоресценция след 15 минути.
(Флуоресцентен сигнал в различни реакции на MIRA)
(Развитието на цветовете на тестовите ленти в различни реакции на MIRA и изчисляването на количественото определяне на интензивността)
Експериментален извод
Експерименталните резултати показаха, че двойната MIRA има добра специфичност и може точно да получи продуктите за усилване на CAMV35s и NOS. Системите Cas13a и Cas12a реагират независимо, без да се намесват помежду си. Тестът MR-DCA може точно да открие 20 копия при ниска температура от 35 минути, което има голяма стойност за откриване на генетично модифицирани култури в полето.
Информация за статията
Име на списанието: 《Journal of Advanced Research Express
Заглавие на статията: 《Развитие на нов CAS13a/CAS12A-медииран „едно-футово“ анализ за двойно откриване за генетично модифицирани култури експреси
Коефициент на въздействие: 11.4
Изследователски екип: Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences