Статията предлага нова технология за микрофлуидна чип за мултиплекс откриване на патогенни микроорганизми на скариди. Изследователският екип интегрира мулти-ензимната изотермична технология за бързо усилване на нуклеиновата киселина (MIRA) и методите за откриване на флуоресценция в реално време. Този микрофлуиден чип осигурява бързо, чувствително и ефективно решение за откриване на на място основни патогени на скаридите.
Изследователски опит и значимост
Глобалната индустрия за земеделие на скариди е един от най -важните икономически компоненти в аквакултурата, но индустрията отдавна е изправена пред заплахи от различни патогенни микроорганизми. Тези патогени често водят до мащабна смърт на скариди, сериозно засягащи производствените и икономическите ползи. Включително остра болест на хепатопанкреатичната некроза (AHPND), вирус на синдром на бялото петно (WSSV), инфекциозен хиподермален и хематопоетичен некроза вирус (IHHNV), хемоцит на скариди иридовирус (шив) и Enterohepaticus (EHP), и др.
Традиционните методи за откриване на патогени, като полимеразна верижна реакция (PCR технология), имат висока чувствителност и специфичност, но са сложни за работа, отнема много време и разчитат на лабораторно оборудване. Тези ограничения правят PCR технологията неподходяща за бързо тестване на място. Технологията MIRA се превърна в молекулярен инструмент за откриване, подходящ за приложение на място поради своите бързи характеристики на усилване при постоянна и нормална температура.
Технологичен принцип на Mira
Мулти-ензимната технология за усилване на бързо температурата на нуклеиновата киселина (Mira Technology) е технология за усилване на постоянна температура, която разчита на синергията на множество функционални протеини при стайна температура за постигане на бързо амплификация на нуклеиновите киселини. Това е наистина преносима технология за откриване на бързо откриване на нуклеинова киселина. В сравнение с PCR, MIRA има повече предимства.
Дизайн и иновации на микрофлуидни чипове
Схематична диаграма на платформата за откриване на RPA на чип за няколко важни скариди патогенни микроорганизми
А) Структура на микрофлуиден чип от дисков тип. 1: Реакционна камера; 2: топка клапан; 3: изпускателен порт; 4: Порт за вземане на проби;
(Б) Взривен изглед. 5: Филм за запечатване на топлина; 6: чип субстрат.
В) Подробно оформление на шестте набора праймери в сектора. Всеки набор от грунд е предварително фиксиран в определена реакционна камера.
(D) Пълна оперативна процедура на чип RPA платформа за откриване на RPA.
Статията предлага микрофлуиден чип, интегриран с MIRA технология за мултиплекс откриване на патогенни микроорганизми на скариди. Микрофлуидната технология може да контролира течностите в канали на микроново ниво за прецизна манипулация, като по този начин постига ефективно и нискотарифно многоцелево откриване.
Чипът има следните ключови дизайнерски функции:
● Центробежен микрофлуиден чип
Чипът приема центробежен дизайн на задвижването, като използва центробежна сила за равномерно разпределение на пробата във всяка реакционна камера. Този дизайн опростява процеса на работа и операторът може да завърши цялата реакция, като просто инжектира пробата.
● Откриване на многоцелеви
Чипът е предварително вграден с бактериалните видове, които трябва да бъдат открити: остра хепатопанкреатична некроза (V-AHPND), вирус на синдром на бялото петно (WSSV), инфекциозен подкожен некроза вирус (IHHNV), хемоцитен хемоцит иридовирус. ) Праймерни сонди за пет патогена. Този дизайн може едновременно да открие шест генни цели в една реакция, което позволява бърз скрининг на множество патогени.
● Откриване на флуоресценция в реално време
Реакцията на усилване на технологията MIRA в чипа се комбинира с флуоресцентна сонда, която може да наблюдава напредъка на реакцията на амплификация в реално време. Дизайнът на сондата позволява да се освободи флуоресцентният сигнал само когато се генерира амплификационният продукт, като по този начин се постига бързо и чувствително количествено откриване.
● Система за реакция с ниска концентрация
Всяка реакционна единица на чипа изисква само реакционен обем от 5 μl, което значително намалява консумацията на реагент. Когато цялата система работи, до четири проби могат да се обработват едновременно и всяка проба може да открие пет патогена, като значително подобрява ефективността на откриване.
Чувствителност, специфичност и повторяемост
Производителността на чип системата включва откриване на симетрия, резонанс и повторяемост.
● Чувствителност
Експерименталните резултати показват, че чипът може да открие номера за копиране на целеви ген до 10 копия/μL, с чувствителност, която е сравнима или дори по -висока от традиционните PCR методи. Тази висока чувствителност гарантира, че технологията може да открие ранно заразени индивиди в практически приложения, като по този начин дава възможност за ранен скрининг на патогени.
● Специфичност
Експериментът проведе тестове за кръстосана реакция на различни нецелеви патогени и резултатите показват, че чипът е силно специфичен за целевите патогени и може точно да разграничи различни видове патогени. All tests for Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (V-AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV), Shrimp Hemacytic Iridescence Virus (SHIV) and Enterohepatitis Hepatica (EHP) The results all showed no cross-reaction, indicating that this method can effectively avoid Неспецифично усилване.
● Повторяемост
За да се оцени стабилността на метода, изследователският екип проведе множество многократни експерименти. Резултатите показват, че коефициентът на вариация (стойността на CV) между различните експерименти е по -малък от 10%, което показва добра експериментална повторяемост и консистенция.
Полеви приложения и предимства
Дизайнът на микрофлуидния чип на Mira Technology дава значителни предимства на приложението, особено подходящ за бързо откриване и мониторинг на патогени в отглеждането на скариди:
● Удобен процес на работа
Целият процес на откриване изисква само инжектиране на пробата в чипа и стартиране на реакционното устройство. Той изисква почти никаква ръчна работа и е подходящ за непрофесионалисти, които да се използват на място.
● Възможност за бърза реакция
Системата може да получи резултати от тестовете в рамките на 20 минути, като значително съкращава времето за изпитване. Това е от решаващо значение за бързата реакция на заболяването във фермите и намаляване на разпространението на патогени.
● Възможност за откриване на мултиплекс
Пет основни патогени могат да бъдат идентифицирани в един тест, което значително подобрява ефективността на откриване и спестява разходи за откриване и време.
Технологични перспективи на Mira
Въпреки че PCR технологията отдавна е оценена като златен стандарт за откриване на амплификация на нуклеинова киселина, Mira технологията демонстрира голям потенциал за приложение поради бързата си реакция при постоянна температура, проста работа и изисквания за ниско оборудване. Сравнявайки с PCR, комбиниран с секвениране на ДНК, беше установено, че резултатите от откриването на изотермичния амплификационен чип са в съответствие с резултатите от PCR по отношение на чувствителността и специфичността, а времето за реакция на MIRA технологията е значително съкратено. Следователно микрофлуидните чипове MIRA се считат за технология, по-подходяща за полеви приложения, особено в среди, които изискват бързо и мащабно откриване на патогени.
Микрофлуидните чипове, базирани на мулти-ензимна изотермична технология за бързо усилване на нуклеиновата киселина (MIRA), осигуряват ефективен инструмент за откриване на патогенни микроорганизми в отглеждането на скариди. Тази технология има предимствата на високата чувствителност, добрата специфичност, лесната експлоатация и скоростта на бързо откриване и има широки перспективи за приложение в превенцията и контрола на аквакултурите. С по -нататъшното развитие и оптимизиране на технологията се очаква системата да се прилага при откриването на повече водни патогени, което позволява по -широка профилактика и мониторинг на заболяването.
Резултатите от изследванията осигуряват надежден метод за ранно откриване на аквакултурната индустрия, който може ефективно да намали риска от огнища на болести, да подобри ефективността на производството и производството на стопанствата и да постави техническа основа за устойчивото развитие на аквакултурната индустрия.