Регулируемият контрол на активността на Cas12 насърчава универсално и бързо-откриване на нуклеинова киселина в един съд
Публикувано от: Университет за наука и технологии на Китай
Вестник: Nature Communications
Импакт фактор: 14.7
С помощта на технологията MIRA беше разработен универсален метод за откриване на флуоресцентна нуклеинова киселина в един съд (SURVEY) на базата на натриев хепарин. Проучванията показват, че натриевият хепарин може да регулира активността на разцепване на Cas12a чрез намеса в процеса на свързване на Cas12a-crRNA. Чрез регулиране на концентрацията на натриев хепарин SURVEY е съвместим както с класически, така и с неоптимални PAM последователности и е приложим за множество подтипове Cas12. Този метод, с време за откриване от само 15-20 минути, постига чувствителност и специфичност над 95% за откриване на псевдовирус на маймунската шарка, вирус на грип A и SARS-CoV-2. Той е с ниска-цена и предоставя нов метод за откриване на място за диагностика на медицинско място и мониторинг на околната среда, като се справя с трудния баланс между чувствителност и специфичност в традиционната CRISPR диагностика.
1. Изследване на механизма на действие на хепарин натрий
Флуоресцентна сонда беше добавена към системата Cas12a-crRNA, съдържаща 10 nM целева ДНК, и беше наблюдаван бърз и значим флуоресцентен сигнал без добавянето на натриев хепарин. Когато беше добавен 0,2 ug/ml натриев хепарин, флуоресцентният сигнал беше подобен на този на контролната група, което показва, че натриевият хепарин силно инхибира активността на транс-разцепване на Cas12a. 0.2ug/ml натриев хепарин е минималната инхибираща концентрация. Тъй като концентрацията на натриев хепарин се повишава от 0,2 ug/mL до 0,5 ug/mL, активността на цис-разцепване на Cas12a постепенно се инхибира, а при 0,5ug/mL активността на транс-разцепване е почти напълно инхибирана. Изследвания върху механизма на действие на натриевия хепарин показват, че отрицателно заредените групи на натриевия хепарин пречат на правилното свързване на crRNA с Cas12a и могат да повлияят на образуването на бинарния комплекс crRNACas12a.
- MIRA-Cas12a едно-откриване на пот
След утвърждаване на механизма на действие на натриевия хепарин, документът изследва стратегия за откриване в един-саксий (MIRA-Cas12a), комбинираща усилване на MIRA и Cas12a-медиирано флуоресцентно откриване в една епруветка.
В отсъствието на натриев хепарин комбинацията MIRA-Cas12a не продуцира значителен флуоресцентен сигнал в диапазона на концентрация на целевия ген от 0,1 aM до 10fM. При 40 µg/mL натриев хепарин се наблюдава значителен флуоресцентен сигнал в обхвата на целевата концентрация от 1aM (≈0,6 копия/μL, обем=30μL) до 10fM (≈6000 копия/μL, обем=30μL), демонстрирайки над 10 000-кратно подобрение на чувствителността на откриване в сравнение със система без натриев хепарин.
Концентрацията на матрицата на вируса на маймунската шарка беше 10 fM и Cas12a-crRNA (100 nM) беше използвана за откриване на целевите гени f31 и b6r. Реакцията на амплификация беше прекратена на 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 20 минути и съдържанието на продукта на амплификация на MIRA в различни моменти беше анализирано върху агарозни гелове. След това получените продукти бяха анализирани върху агарозни гелове при три различни настройки: MIRA-хепарин натрий без Cas12a, MIRA-Cas12a без хепарин натрий и MIRA-Cas12a с хепарин натрий. Резултатите показват, че в отсъствието на хепарин натрий, амплификацията на нуклеинова киселина е възпрепятствана поради високата цис-активност на разцепване на Cas12a. Въпреки това, добавянето на хепарин натрий значително повишава амплификацията на нуклеинова киселина поради намаляването на активността на цис-разцепване на Cas12a.
Статията демонстрира, че универсален-метод за откриване на флуоресцентна нуклеинова киселина (SURVEY), базиран на натриев хепарин, може да бъде постигнат, като се използват както класически PAM, така и неоптимални PAM последователности. В допълнение, в допълнение към LbCas12a, AsCas12a и AapCas12b също се използват широко в CRISPR-Dx методите. В системата, използваща MIRA-AsCas12a, флуоресценция се наблюдава само в присъствието на 40 ug/mL натриев хепарин, което показва, че може да открие 1fM от f31 и b6r гени. При липса на натриев хепарин MIRA-AapCas12b може да открие 1 ген f31 и b6r. Прилагането на 20 ug/mL натриев хепарин не само ускорява степента на откриване на MIRA-AapCas12b, но също така повишава интензитета на флуоресценция. Тези констатации показват, че методът с една-пот, разработен с помощта на дозиране на натриев хепарин, е приложим и за други подтипове Cas12.
