Видимо и бързо откриване на котешки chaphamaparvovirus с помощта на мултиензимно изотермично бързо усилване и тест с пръчка за измерване на страничен поток
Журнал: Граници в клетъчната и инфекциозна микробиология
Импакт фактор:4.6
Котешки чафамапарвовирус(FeChPV)е нов парвовирус, открит за първи път при котки с диария в Канада през 2019 г. Неговата патогенност и молекулярни характеристики остават неясни и той проявява гостоприемник и генетично разнообразие, което изисква допълнително епидемиологично изследване. Понастоящем няма стандартизиран метод за откриване на FeChPV.
Мултиензимен изотермичен метод с бърза амплификация-на измервателна пръчка за страничен поток (MIRA-LFD)се използва успешно за откриване на различни вируси, като предлага предимства като бързина, простота и липса на нужда от прецизни инструменти. Изследователският екип създаде MIRA-LFD метод, подходящ за FeChPV за справяне с предизвикателствата при масовото клинично откриване. Без да разчитате на прецизни инструменти,методът MIRA-LFD завърши откриването на FeChPV при 37 градуса в рамките на 20 минути и не показа кръстосана-реактивност с други вируси. Границата на откриване беше 32,3 копия/μL,10 пъти по-висока от PCR метода. Освен това, методът MIRA-LFD откри 29 FeChPV-положителни проби сред 417 котки с диария, с процент на положителност, малко по-висок от този на вложения PCR метод. Тези резултати показват, че установеният MIRA-LFD метод за откриване на FeChPV е ефикасен, икономичен, надежден и прост метод, допринасящ за ранната превенция и контрол на FeChPV инфекцията.
1.Експериментални методи
Клинични проби:Пробите от ректален тампон, използвани в това проучване, са събрани от 632 котки (включително 417 с диария и 115 здрави котки) и 474 кучета (включително 342 с диария и 132 здрави кучета) във ветеринарни клиники в провинциите Гуангдонг, Хенан, Анхуей, Жедзян и автономния регион Вътрешна Монголия между 2022 и 2024 г.
Амплификация на нуклеинова киселина:Екстрахираната ДНК нуклеинова киселина се добавя към системата MIRA. Рекомбиназата и праймерите образуват комплекс; с помощта на спомагателни протеини и едно-верижни свързващи протеини, те нахлуха в двойно-верижната ДНК матрица. Праймерите се свързват с хомоложни комплементарни региони, за да образуват бримкова област D-, докато рекомбиназата се разглобява от комплекса. Полимеразата се свързва с 3' края на праймерите и инициира синтеза на ДНК, експоненциално усилвайки целевия регион върху матрицата. Този процес се извършва бързо и ефективно, като по този начин се постига ултра{8}}усилване на целевия фрагмент само за 15 минути.
Развитие на цвета на тест лентата:Продуктът от амплификация на нуклеинова киселина се разрежда 1:10, нанася се върху тест лентата и резултатите се отчитат след 5 минути.
Целият процес от амплификацията на нуклеинова киселина до оцветяването на тест лентата отне само 20 минути.
В експеримента бяха използвани -бъдещи биологични продукти:
В проучването бяха проверени четири проектирани набора от специфични комбинации от праймер-сонда. За представяне на резултатите бяха използвани както електрофореза с агарозен гел, така и тестови ленти за нуклеинова киселина. И четирите комбинации от праймер-сонда могат да открият FeChPV вируса. Според резултатите от електрофорезата в агарозен гел, комбинацията FeChPV-4 показва най-ярката целева лента, така че тази комбинация е избрана за последващо тестване.
Според резултатите от електрофорезата в агарозен гел, амплификацията за 5, 10, 15 и 20 минути дава целевата лента. Интензитетът на целевата лента достигна своя връх на 15 минути от амплификацията, установявайки 15 минути като оптимално време за реакция за този анализ. Усилването при 36 градуса, 37 градуса, 38 градуса, 39 градуса и 40 градуса дава целевата лента, като най-ярката ивица се наблюдава при 39 градуса, установявайки 39 градуса като оптимална реакционна температура за този анализ.
(Фигура A: 1: Усилване 5 минути; 2: Усилване 10 минути; 3: Усилване 15 минути; 4: Усилване 20 минути) (Фигура B: 1: Усилване 36 градуса; 2: Усилване 37 градуса; 3: Усилване 38 градуса; 4: Усилване 39 градуса; 5: Усилване 40 градуса)
2. Ефективност на откриване
Чувствителност:
(Фигура A: Резултати от MIRA, представени чрез електрофореза в агарозен гел)
(Фигура B: Вложени резултати от PCR, представени с помощта на електрофореза в агарозен гел)
(Фигура C: Резултати от MIRA, представени с помощта на тест ленти за нуклеинова киселина)
Пробите бяха подложени на 10-кратни серийни разреждания, като се започне от 3,23 × 10⁶ копия/μL. Вложената PCR с електрофореза в агарозен гел може стабилно да открие 3,23×10² копия/μL; MIRA с електрофореза в агарозен гел и MIRA с тест ленти за нуклеинова киселина могат да открият стабилно 3,23×10¹ копия/μL.
Методът MIRA показа постоянна чувствителност при използване на два различни формата за представяне на резултатите и чувствителността на метода MIRA беше по-добра от тази на вложената PCR.
Специфичност:
(1: FeChPV, котешки чафамапарвовирус; 2: FPV, котешки вирус на панлевкопения; 3: FeAstV, котешки астровирус; 4: FBoV, котешки бокавирус; 5: CachaV, кучешки чапарвовирус; 6: отрицателна контрола)
Новосъздаденият метод MIRA-LFD откри само FeChPV и не показа кръстосана-реактивност с други референтни вируси, което показва добра специфичност.
3. Резюме на изследването
Това проучване установи MIRA-LFD метод за откриване на FeChPV без необходимост от високо-прецизни инструменти. Като ефикасен, икономичен и надежден метод за откриване с висока чувствителност и специфичност, методът MIRA-LFD е по-подходящ за клинично откриване, осигурявайки техническа поддръжка за ранна превенция и контрол на FeChPV инфекция.
4.AMP-БЪДЕЩА БИОТЕХНОЛОГИЯ
Мултиензимната изотермична бърза амплификация на нуклеинова киселина MIRA е технология, която наистина позволява бързо откриване на -на място.
Технологията MIRA се основава на механизма за възстановяване на генна рекомбинация in vivo, разчитайки на синергичното действие на множество функционални протеини при стайна температура за постигане на бърза (5-20 минути), чувствителна, специфична и безопасна амплификация на нуклеинова киселина при стайна температура (25 градуса –45 градуса). Поради изотермичния характер на технологията MIRA, тя има ниски изисквания към оборудването и проста работа. Чрез миниатюризирани преносими устройства, той може да се прилага при тестване на първа линия в различни сценарии на приложение, осигурявайки бързо и точно тестване на нуклеинови киселини в настройки като POCT, тестване в домашни условия, селскостопански полета и -правоприлагащи органи на място. Въз основа на технологията MIRA, Amp-future Biotech разработи серия от-продукти за бързо тестване на място, включително агенти за бързо освобождаване на нуклеинова киселина, изотермични реагенти за бързо усилване на нуклеинова киселина, колоидни златни тест ленти и миниатюрно преносимо оборудване, създавайки цялостно решение за-бързо молекулярно тестване на място. Освен това технологията MIRA на Amp-future предлага предимства на приложението, когато се комбинира с технологията CRISPR, NGS, SNP, микрофлуиди и др.
В допълнение към серията от-продукти за бързо тестване на място, показани по-горе, Amp-future Biotech също така предоставя:
Изследователски реактиви:Осигуряване на суровини за реагенти и техническа поддръжка за фундаментални научни изследвания, както и литературни справки по проекта.
OEM производство:Възможност за самостоятелно производство на крайни продукти с висока-чистота и висока{1}}активност през целия процес, постигайки производство в-промишлен мащаб.
Разработка по поръчка на проекта:Информация за последователността и резултати от анализа на подравняването на последователността, проектиране и синтез на праймер-сонда за проект, синтез на плазмид и проби за проект, доклади и резултати от проекта и др.
За повече информация, заповядайте на запитване.