За да постигнем усилване на сигнала за следи от вирусни нуклеинови киселини и да осигурим достатъчно субстрати за Cas14a, ние разработихме aMIRA (асиметрично мултиензимно изотермично бързо усилване), базирано на MIRA. Получената система aMIRA-Cas14a предлага следните ключови предимства:
1. Оптимизираната стехиометрия на праймера позволява на MIRA преференциално да свръхпродуцира ssDNA, която служи като директен субстрат за Cas14a. Чрез регулиране на съотношението на прав-към-обратен праймер до 20:1, системата генерира достатъчно ssDNA, за да активира PAM-независимата активност на разцепване на Cas14a, която специфично разпознава и разцепва ssDNA.
2. Еднопосочна интеграция на MIRA и CRISPR-Cas14a елиминира рисковете от кръстосано замърсяване.
3. MIRA значително подобрява чувствителността на откриване, позволявайки откриването на вирусни нуклеинови киселини с изключително ниско съдържание.
4. aMIRA-Cas14a поддържа висока специфичност, избягвайки фалшиви положителни резултати, причинени от неспецифично усилване.
В крайна сметка еднокомпонентната интеграция на MIRA и CRISPR-Cas14a елиминира рисковете от замърсяване и постига перфектна синергия между силните страни на MIRA и системата CRISPR-Cas14a. Това разрешава предизвикателството за цялата индустрия на несъвместимостта между изотермичното усилване и CRISPR системите, представляващи основния технологичен пробив на платформата MaC14a. Системата aMIRA-Cas14a постига 1000-кратно подобрение на чувствителността, като същевременно осигурява специфично усилване. В комбинация със специфичното за последователността разпознаване на Cas14a, това осигурява валидиране на двуслойна специфичност, без кръстосана реактивност срещу нецелеви вируси или здрави проби-насочвайки се към друга болезнена точка в индустрията: тенденцията за фалшиви положителни резултати.
Мултиензимните изотермични реагенти за бързо усилване на MIRA, използвани в това проучване, са предоставени от Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Освен отличното представяне на реагента, Amp‑future Biotech предлага също професионален и бързо реагиращ екип за техническа поддръжка.
MIRA демонстрира силна съвместимост с центрофужни-микрофлуидни чипове, разработени за изследователски и диагностични приложения:
1. Миниатюризирана реакционна система, подходяща за реакционните камери с микро-обем, характерни за микрофлуидните чипове;
2. Възможност за мултиплексно откриване в едно изпълнение;
3. Съвместимост с преносими устройства, плавен работен процес от проба до резултат.
създадохме интегрирано преносимо устройство за тестване на грижи (POCT), оптимизирано за внедряване на място, както е показано на фигура. 4A. Компактният прототип (23 см (Д) × 21 см (Ш) × 14 см (В), 12,5 кг обща маса) постига изключителна преносимост. Основните компоненти на системата включват високо{11}}прецизен серво мотор за прецизно управление на въртенето и модул за нагряване на въздух за регулиране на температурата. Интегриран модул за оптично откриване, разположен под чипа, улеснява възбуждането и измерването на флуоресценцията, осигурявайки висока чувствителност и точност при откриването. Преносимото устройство е оборудвано с вградена операционна система Android, предлагаща удобен за потребителя-интерфейс, където операторите могат да избират предварително програмирани работни файлове, съдържащи подробни параметри като време за реакция и температура. Резултатите и заключенията се показват в реално-време на LCD екран, позволявайки бързо получаване на информация. Освен това системата включва безжичен комуникационен модул, който поддържа предаване на данни в реално-време към мобилни устройства или облачни сървъри, интегрирайки се с алгоритми за изкуствен интелект за незабавна интерпретация и анализ на резултатите от теста.
