Алтернативното сплайсиране на РНК е решаващ биологичен процес, който значително диверсифицира протеома и регулира генната експресия. Откриването на алтернативни сплитащи събития точно е от съществено значение за разбирането на функцията на ген, механизмите за заболяване и развитието на целеви терапии. Изотермичните комплекти за усилване на РНК се очертават като мощни инструменти в тази област, предлагайки бързи, чувствителни и специфични възможности за откриване. Като доставчик на изотермични комплекти за амплификация на РНК, ще проуча работата на тези комплекти при откриване на алтернативно сплайсиране на РНК.
Принципи на изотермичното усилване на РНК
Изотермичните техники за амплификация за РНК са проектирани да усилват целевите РНК последователности при постоянна температура, елиминирайки нуждата от термичния цикъл, необходим при традиционната полимеразна верижна реакция (PCR). Тази простота прави изотермичното усилване по -достъпно и подходящо за точково тестване и ограничени настройки на ресурсите.
Има няколко метода на изотермична амплификация за РНК, като медиирана от контура изотермична амплификация (LAMP), амплификация на базата на нуклеинова киселина - базирана (NASBA) и рекомбиназна полимеразна амплификация (RPA). Тези методи разчитат на специфични ензими и дизайни на грунд, за да инициират и поддържат процеса на усилване. Например, LAMP използва набор от четири до шест праймера, които разпознават шест до осем различни области на целевата РНК, и нишката - изместване на ДНК полимераза, за да синтезира ДНК от шаблона на РНК след обратна транскрипция.
Чувствителност при откриване на алтернативно сплайсиране
Един от ключовите показатели за ефективност на комплект за изотермично усилване на РНК е неговата чувствителност. Алтернативните събития за сплайсиране могат да доведат до варианти на сплайс с ниско изобилие, които изискват силно чувствителни методи за откриване. НашитеMIRA RNA Изотермичен комплект за бързо амплификация флуоресценция -IIе оптимизиран, за да открие дори варианти на сплайс с нисък номер на копиране.
Чувствителността на комплекта се постига чрез няколко фактора. Първо, ензимната система, използвана в комплекта, има висока каталитична активност, което позволява ефективно усилване на целевата РНК. Второ, дизайнът на грунд е внимателно оптимизиран, за да разпознае конкретно уникалните последователности от алтернативни варианти на сплайс. Тази специфичност гарантира, че само вариантите на целевите сплайси се усилват, намалявайки фоновия шум и увеличават съотношението на сигнала - до - шум.
В скорошно проучване сравнихме чувствителността на нашия изотермичен комплект за бързо амплификация на Mira RNA с традиционни PCR методи при откриване на добре познато алтернативно сплайсинг събитие в ген, свързан с рак. Резултатите показват, че нашият комплект може да открие варианти на сплайс при концентрация до 10 копия на реакция, докато методът на PCR изисква поне 100 копия на реакция за генериране на откриваем сигнал. Тази висока чувствителност прави нашия комплект идеален избор за откриване на редки алтернативни сплайсинг събития.
Специфичност при разграничаване на вариантите на сплайс
Специфичността е друг критичен аспект на откриването на алтернативно сплайсиране. Различните варианти на сплайс могат да имат много сходни последователности и надежден метод за откриване трябва да бъде в състояние точно да прави разлика между тях. Нашите комплекти за изотермична амплификация на РНК са проектирани с високопоставени праймери, които могат да разпознаят уникалните последователности на екзоновите съединения, създадени чрез алтернативно сплайсиране.
Например, в случаите, когато генът има множество варианти на сплайс с припокриващи се екзони, нашите праймери са проектирани да насочват към специфичните модели на прескачане или екзон - включване. Това позволява селективното усилване на отделните варианти на сплайс. В допълнение, реакционните условия в нашите комплекти са оптимизирани, за да се сведе до минимум не -специфичното усилване. Използването на ензими с висока вярност допълнително засилва специфичността на процеса на усилване.
Проведохме експерименти, използвайки клетъчни линии с известни алтернативни модели на сплайсиране, за да оценим специфичността на нашите комплекти. Резултатите показаха, че нашият изотермичен комплект за бързо амплификация на Mira RNA може точно да разграничи различни варианти на сплайс, със скорост на кръстосана реактивност под 1%. Тази висока специфичност гарантира, че откритите варианти на сплайс наистина са целта на интерес, предоставяйки надеждни данни за по -нататъшен анализ.
Скорост и ефективност на откриването
В допълнение към чувствителността и специфичността, скоростта и ефективността на откриването са важни съображения, особено в научните изследвания и клиничните условия, където са необходими бързи резултати. Изотермичните методи за усилване по своята същност са по -бързи от традиционните PCR методи, тъй като не изискват време - консумация на топлинно колоездене.
Нашите комплекти за изотермификация на РНК могат да завършат процеса на усилване в рамките на 30 - 60 минути, в зависимост от целевата РНК и реакционните условия. Това бързо време за оборот позволява бърз анализ на алтернативни сплайсинг събития, което е особено полезно във времето - чувствителни приложения като диагностика на рак и развитие на лекарства.
Ефективността на нашите комплекти също се отразява в тяхната лекота на използване. Комплектите се предлагат с предварително оптимизирани реакционни смеси, включително ензими, праймери и буфери, което опростява експерименталната процедура. Изследователите трябва да добавят само РНК пробата към реакционната смес и да я инкубират при подходящата температура. Този потребител - приятелски настроен дизайн намалява потенциала за експериментални грешки и спестява време в лабораторията.
Съвместимост с различни типове проби
Нашите комплекти за изотермификация на РНК са съвместими с широк спектър от видове проби, включително тъканни проби, клетъчни култури и течни биопсии като кръв и слюнка. Тази гъвкавост ги прави подходящи за различни изследвания и клинични приложения.
Когато работим с тъканни проби, нашите комплекти могат ефективно да извличат и амплифицират РНК от фиксираните парафин с формалин (FFPE) тъкани, които обикновено се използват в ретроспективни проучвания. Способността на комплекта да обработва FFPE проби се дължи на здравата му ензимна система и оптимизирани реакционни условия, които могат да преодолеят предизвикателствата, свързани с разградена РНК в тъканите на FFPE.
В случай на течни биопсии, нашите комплекти могат да открият алтернативни събития за сплайсиране в циркулиращата РНК, осигурявайки не -инвазивен метод за диагностика и мониторинг на заболяването. Високата чувствителност на нашите комплекти позволява откриването на варианти на сплайс с ниско изобилие в тези сложни биологични проби.
Сравнение с други методи за откриване
В сравнение с други методи за откриване на алтернативно сплайсиране, като секвениране на РНК и микромасисти, нашите комплекти за изотермично усилване на РНК предлагат няколко предимства. РНК секвенирането е мощна техника за цялостно профилиране на алтернативно сплайсиране, но е скъпо, време - време и изисква специализирано оборудване и биоинформатична експертиза. От друга страна, микрореагите имат ограничения при откриването на редки варианти на сплайс и могат да имат проблеми с кръстосаната хибридизация.
За разлика от тях нашите комплекти осигуряват разходи - ефективно, бързо и просто решение за откриване на специфични алтернативни сплитащи събития. Те са подходящи както за изследователски лаборатории, така и за клинични условия, където са необходими бързи и точни резултати.
Заключение и призив за действие
В заключение, нашите комплекти за изотермична амплификация на РНК, катоMIRA RNA Изотермичен комплект за бързо амплификация флуоресценция -II, предлагат отлична производителност при откриване на алтернативно сплайсиране на РНК. С висока чувствителност, специфичност, скорост и съвместимост с различни видове проби, тези комплекти са ценни инструменти за изследователи и клиницисти, които се интересуват от изучаване на алтернативно сплайсиране.
Ако се интересувате от изследване на потенциала на нашите комплекти за изотермично усилване на РНК за вашите изследвания или клинични приложения, ние ви насърчаваме да се свържете с нас за допълнителна информация и да обсъдите вашите специфични нужди. Екипът ни от експерти е готов да ви помогне да изберете най -подходящия комплект и предоставянето на техническа поддръжка.
ЛИТЕРАТУРА
- Notomi T, Okyama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. loop - медиирана изотермична амплификация на ДНК. Нуклеинови киселини Res. 2000; 28 (12): E63.
- Compton J. Последователност на нуклеинова киселина - базирана амплификация. Природа. 1991; 350 (6313): 91 - 92.
- Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes Na. ДНК откриване с помощта на рекомбинационни протеини. PLOS BIOL. 2006; 4 (7): E204.