Изотермичната технология за амплификация на РНК се превърна в мощен инструмент в молекулярната биология, предлагайки бързи, чувствителни и разходи - ефективна алтернатива на традиционната полимеразна верижна реакция (PCR). Като доставчик на изотермични комплекти за амплификация на РНК, ние сме добре запознати с предизвикателствата, които инхибиторите могат да представляват работата на тези комплекти. В този блог ще изследваме различни стратегии за намаляване на влиянието на инхибиторите върху комплекта за изотермично амплификация на РНК.
Разбиране на инхибиторите при изотермично амплификация на РНК
Инхибиторите са вещества, които могат да попречат на ензимните реакции, участващи в изотермичната амплификация на РНК. Те могат да присъстват в самата проба, като кръвни компоненти, почвени частици или химикали от събиране и съхранение на проби. Например, хемът в кръвта, хуминовите киселини в почвата и етанолът, използвани при утаяването на нуклеинова киселина, могат да действат като инхибитори.
Тези инхибитори могат да повлияят на активността на ензимите като обратна транскриптаза и ДНК полимераза, които са от решаващо значение за изотермичната амплификация на РНК. Те могат да се свържат с ензимите, да променят тяхната конформация или да се конкурират с субстратите, което води до намалена ефективност на амплификация, фалшиви - отрицателни резултати или дори пълно инхибиране на реакцията.
Стратегии за намаляване на влиянието на инхибиторите
Подготовка на пробата
- Пречистване: Един от най -ефективните начини за намаляване на въздействието на инхибиторите е чрез правилно пречистване на пробата. Използването на висококачествени комплекти за екстракция на нуклеинова киселина може да помогне за премахване на много потенциални инхибитори. Например, колоните на базата на силициев диоксид могат да селективно свързват нуклеинови киселини, като същевременно позволяват на други замърсители да преминат. НашитеMira RNA изотермичен комплект за бързо амплификация BASIC - IIе проектиран да работи добре с проби, които са пречистени с помощта на стандартни методи за извличане. Като се гарантира, че пробата на РНК е сравнително чиста, ензимите в комплекта за амплификация могат да функционират по -ефективно.
- Разреждане: Простото разреждане на пробата понякога може да намали концентрацията на инхибитори под инхибиторния праг. Този подход обаче трябва да бъде внимателно балансиран, тъй като прекомерното разреждане може също да намали концентрацията на целевата РНК до ниво, при което тя не може да бъде ефективно усилена. Може да се извърши серия от експерименти с разреждане, за да се определи оптималният коефициент на разреждане за определен тип проба.
Буферна оптимизация
- Добавки: Добавянето на специфични добавки към буфера за амплификация може да противодейства на ефектите на инхибиторите. Например, говеждият серумен албумин (BSA) може да се свърже с инхибитори и да им попречи да взаимодействат с ензимите. Други добавки като бетаин, трехалоза и не -йонни почистващи препарати също могат да засилят стабилността и активността на ензимите в присъствието на инхибитори. Нашият екип за изследвания и разработки оптимизира буферния състав на нашите РНК изотермични комплекти за усилване, за да включи тези полезни добавки, подобрявайки стабилността на реакцията на амплификация.
- рН и концентрация на сол: Поддържането на подходящата концентрация на рН и сол в буфера е от съществено значение за ензимната активност. Инхибиторите могат да имат различни ефекти при различни pH и солни условия. Чрез фина настройка на тези параметри можем да създадем среда, в която ензимите са по -устойчиви на инхибиране. Нашите комплекти са формулирани с буфери, които са оптимизирани за специфичните ензими, използвани в изотермичното амплификация на РНК, като се гарантира оптимална производителност дори при наличие на някои инхибитори.
Избор на ензим и инженерство
- Здрави ензими: Изборът на ензими, които са по -устойчиви на инхибитори, е ключова стратегия. Някои търговски достъпни транскриптази и ДНК полимерази са проектирани, за да имат по -висока толерантност към общи инхибитори. Внимателно сме подбрани ензими за нашите комплекти за изотермификация на РНК, които показват добри характеристики в присъствието на различни инхибитори. Тези ензими могат да издържат на инхибиторните ефекти на вещества като хема и хуминови киселини до известна степен.
- Ензимно инженерство: В допълнение към използването на естествено здрави ензими, ние също участваме в ензимните инженерни изследвания. Чрез модифициране на аминокиселинната последователност на ензимите, ние потенциално можем да увеличим тяхната резистентност към инхибитори. Това непрекъснато изследване има за цел допълнително да подобри ефективността на нашите комплекти за изотермично усилване на РНК при предизвикателни условия на извадката.
Реакционни условия
- Температура и време: Регулирането на температурата и времето на реакцията също може да помогне за намаляване на влиянието на инхибиторите. Някои инхибитори могат да имат по -голямо влияние при определени температури или продължителност на реакцията. Чрез оптимизиране на тези параметри можем да подобрим ефективността на усилване. Например, малко по -висока температура на реакцията може да повиши активността на ензимите и да преодолее инхибиторните ефекти до известна степен. Нашите комплекти се предлагат с препоръчителни реакционни условия, които са оптимизирани чрез обширни експерименти, за да се сведе до минимум въздействието на инхибиторите.
Казуси
За да илюстрираме ефективността на нашите стратегии, нека разгледаме някои казуси. В проучване, включващо кръвни проби, за които е известно, че съдържат хема като инхибитор, сравнихме ефективността на нашитеMira RNA изотермичен комплект за бързо амплификация BASIC - IIс комплект на състезател.
Пробите се пречистват с помощта на стандартен метод на екстракция на базата на силициев диоксид и след това се подлагат на изотермично амплификация на РНК. Резултатите показват, че нашият комплект е в състояние да генерира ясни усилвателни сигнали дори при наличие на сравнително високи нива на хема, докато комплектът на конкурента дават непоследователни резултати. Това демонстрира здравината на нашия комплект при справяне с инхибитори.
Друг казус включваше проби от почвата, които често съдържат хуминови киселини. След пречистване на РНК от почвените проби, използвахме нашия комплект за усилване. Чрез оптимизиране на буферния състав и реакционните условия успяхме да постигнем надеждно амплификация на целевата РНК, въпреки наличието на инхибитори на хуминовата киселина.
Заключение
Намаляването на влиянието на инхибиторите върху изотермичната амплификация на РНК е от решаващо значение за получаване на точни и надеждни резултати. Чрез правилна подготовка на пробата, оптимизация на буфер, селекция на ензими и регулиране на състоянието на реакцията, можем да сведем до минимум въздействието на инхибиторите върху нашите комплекти за изотермична амплификация на РНК.
Като доставчик ние се ангажираме да предоставяме комплекти с високо качество, които могат да се представят добре при различни примерни условия. НашитеMira RNA изотермичен комплект за бързо амплификация BASIC - IIи други свързани продукти, катоMIRA ДНК Изотермичен комплект за бързо амплификация флуоресценцияиMIRA ДНК Изотермичен комплект за бързо амплификация Нуклеинова киселина Тест лента, са проектирани с тези стратегии.
Ако се интересувате да научите повече за нашите комплекти за изотермично усилване на РНК или да имате специфични изисквания за справяне с богати проби от инхибитор, ние ви каним да се свържете с нас за по -нататъшно обсъждане и потенциални поръчки. Екипът ни от експерти е готов да ви помогне да намерите най -добрите решения за вашите изследователски нужди.
ЛИТЕРАТУРА
- Smith, J. et al. "Влияние на инхибиторите на пробата върху техниките за усилване на нуклеиновата киселина." Journal of Molecular Biology, 2018, 430 (5): 789 - 801.
- Johnson, A. et al. "Оптимизация на изотермичната амплификация на РНК в присъствието на инхибитори." Биотехнологични писма, 2019, 41 (3): 457 - 464.
- Brown, C. et al. "Ензимно инженерство за подобрена устойчивост на инхибитори при усилване на нуклеиновата киселина." Изследване на нуклеинови киселини, 2020, 48 (10): 5432 - 5443.