ДНК полимеразата е решаващ ензим в молекулярната биология, играеща централна роля в процесите на репликация и възстановяване на ДНК. В лабораторията пречистването на ДНК полимеразата е педантичен и мулти -стъпков процес, който изисква внимателно планиране и изпълнение. Като доставчик на ДНК полимераза, аз съм добре - запознат с тънкостите на този процес на пречистване и бих искал да споделя подробностите с вас.
Първоначални стъпки: растеж на клетките и лизис
Първата стъпка в пречистващата ДНК полимераза често започва с растящи клетки, които експресират ензима. Обикновено бактериите като Escherichia coli се използват като гостоприемни клетки, тъй като те са лесни за култура, растат бързо и могат да бъдат генетично проектирани за свръхекспресиране на целевата ДНК полимераза. Бактериите обикновено се отглеждат в подходяща културална среда при контролирани условия на температура, рН и аерация. Например, E. coli често се култивира при 37 ° C в богата среда като бульон Luria - Bertani (LB).
След като клетките достигнат подходяща плътност, те се събират чрез центрофугиране. След това клетъчната пелета се ресуспендира в буферен разтвор. За да се освободи ДНК полимеразата от клетките, се извършва етап на лизис. Има няколко метода за клетъчен лизис, включително механични методи (като озвучаване), химични методи (използвайки почистващи препарати като Triton X - 100) и ензимни методи (използвайки лизозим за разграждане на бактериалната клетъчна стена). Озвучаването е популярен избор, тъй като може ефективно да наруши клетките, без да причини значително увреждане на ензима. Въпреки това, тя трябва да бъде внимателно контролирана, за да се избегне прекомерно нагряване на пробата, което може да денатира ДНК полимеразата.
Подготовка и изясняване на суров екстракт
След клетъчния лизис, получената смес съдържа различни клетъчни компоненти, включително протеини, нуклеинови киселини, липиди и клетъчни отломки. Това е известно като суровия екстракт. За премахване на големите мащабни отломки, суровият екстракт се центрофугира с висока скорост. Супернатантата, която съдържа разтворимите протеини, включително ДНК полимеразата, се събира внимателно.
Понякога суровият екстракт все още може да съдържа значително количество нуклеинови киселини, които могат да попречат на следващите етапи на пречистване. За да се отстранят тези нуклеинови киселини, може да се извърши етап на утаяване с помощта на поликационно съединение като полиетиленмин (PEI). PEI се свързва с отрицателно заредените нуклеинови киселини, причинявайки ги да се утаи, които след това могат да бъдат отстранени чрез центрофугиране.
Хроматографско пречистване
Хроматографията е крайъгълен камък на пречистване на ДНК полимераза. Има няколко вида техники за хроматография, които могат да се използват, всеки от които се основава на различни принципи на разделяне.
Йон - обменна хроматография
Йон - обменната хроматография често е първата хроматографска стъпка в процеса на пречистване. Той разделя протеините въз основа на техния нетен заряд. ДНК полимеразите имат характерен заряд при дадено рН, което им позволява да се свързват или с положително заредена (анион -обмен) или отрицателно заредена (катион - обмен) смола. Например, ако ДНК полимеразата има нетен отрицателен заряд при определено рН, може да се използва анион - обменна смола като диетиламиноетил (DEAE) целулоза. Суровият екстракт се зарежда върху колоната и ДНК полимеразата се свързва със смолата, докато други протеини с различни заряди преминават през. След това свързаната ДНК полимераза може да бъде елуирана чрез увеличаване на концентрацията на сол в буфера. Този метод е ефективен за отстраняване на много замърсители и може значително да обогати ДНК полимеразата в пробата.
Афинитетна хроматография
Афинитетната хроматография е силно специфичен метод за пречистване. Той се възползва от специфичното взаимодействие между ДНК полимеразата и лиганд, имобилизиран върху смола. Един често срещан подход е използването на неговата система за тагове. Ако ДНК полимеразата е генетично проектирана, за да съдържа хистидин етикет (неговия - маркер), може да се използва смола никел - нитрилотриоцетна киселина (Ni - NTA). His -Tag се свързва конкретно с никеловите йони върху смолата, което позволява на ДНК полимеразата да се задържа селективно върху колоната. Други протеини, които нямат неговия маркер, ще преминат през колоната. Свързаната ДНК полимераза може да бъде елуирана чрез добавяне на имидазол към буфера, който се конкурира с His - за свързване към никеловите йони.
Друг вид афинитетна хроматография, която може да се използва, е ДНК - афинитетна хроматография. Тъй като ДНК полимеразата има естествен афинитет към ДНК, може да се използва ДНК, съдържаща смола. ДНК полимеразата се свързва с ДНК върху смолата и други не -ДНК -свързващи протеини се отстраняват. След това свързаната ДНК полимераза може да бъде елуирана чрез промяна на буферните условия, като увеличаване на концентрацията на сол или добавяне на конкурентна ДНК.
Размер - Хроматография за изключване
Размер - Хроматография за изключване, известна още като гел - филтрационна хроматография, отделя протеини въз основа на техния размер. Колоната е пълна с порести мъниста. По -малките протеини могат да влязат в порите на мънистата и да имат по -дълъг път през колоната, докато по -големите протеини преминават през пространствата между мънистата и елуират по -рано. Този метод е полезен за отстраняване на всички останали агрегати или замърсители с малки молекулни тегло. Може да се използва и за определяне на молекулното тегло на пречистената ДНК полимераза.
Окончателно пречистване и контрол на качеството
След хроматографските стъпки, ДНК полимеразата обикновено е силно пречистена. Все пак може да има някои незначителни замърсители. Краен етап на полиране, като хидрофобна взаимодействие хроматография или обратна фазова хроматография, може да се извърши за по -нататъшно пречистване на ензима.
След като пречистването приключи, строгите мерки за контрол на качеството са от съществено значение. Чистотата на ДНК полимеразата може да бъде оценена с помощта на техники като натриев додецил сулфат - полиакриламиден гел електрофореза (SDS - Page). Единична лента на гела показва проба с висока чистота. Активността на ДНК полимеразата може да бъде измерена с помощта на in vitro анализ на синтеза на ДНК. Специфичната активност, която е количеството на ензимната активност на единица протеин, е важен параметър за оценка на качеството на пречистената ДНК полимераза.
Други свързани ензими и нашето продуктово портфолио
В допълнение към ДНК полимеразата, нашата компания предлага и редица други висококачествени ензими за лабораторни изследвания. Например имамеGP41 протеин 2.0, който играе важна роля в процесите на репликация на ДНК. Друг продукт еЕкзонуклеаза III 2.0, което е полезно за проучвания за поправяне и модификация на ДНК. И нашитеSC Reca 2.0участва в хомоложна рекомбинация и механизми за възстановяване на ДНК.
Заключение
Пречистването на ДНК полимеразата в лабораторията е сложен, но възнаграждаващ процес. Чрез внимателен растеж на клетките, лизис, хроматографско пречистване и контрол на качеството сме в състояние да получим силно чиста и активна ДНК полимераза. Като доставчик на ДНК полимераза, ние се ангажираме да предоставяме най -висококачествените продукти, за да отговорим на нуждите на научната общност. Ако се интересувате от нашата ДНК полимераза или други ензимни продукти, ние ви каним да се свържете с нас за поръчки и по -нататъшни дискусии. Винаги сме готови да предложим професионални съвети и подкрепа, за да гарантираме, че имате най -добрите подходящи реагенти за вашите изследователски проекти.
ЛИТЕРАТУРА
- Sambrook, J., & Russell, DW (2001). Молекулярно клониране: лабораторен наръчник. Лабораторна преса на Cold Spring Harbour.
- Scopes, RK (1994). Пречистване на протеини: принципи и практика. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Ръководство за пречистване на протеини. Академична преса.