Как да измерим флуоресцентната поляризация?

Флуоресцентната поляризация (FP) е мощна техника, използвана в различни области, включително биохимия, фармакология и наука за околната среда. Като водещ доставчик на детектор за флуоресценция, ние разбираме значението на точните и надеждни FP измервания. В тази публикация в блога ще проучим как да измерим поляризацията на флуоресценцията, от основните принципи до практическите съображения.

Основни принципи на флуоресцентна поляризация

Флуоресцентната поляризация се основава на факта, че когато флуоресцентната молекула се възбужда от поляризирана светлина, излъчената светлина също се поляризира. Степента на поляризация на излъчената светлина зависи от въртящото се движение на флуоресцентната молекула по време на живота на флуоресценцията. Ако молекулата е голяма или е свързана с макромолекула, ротационното му движение е ограничено, а излъчената светлина остава силно поляризирана. И обратно, ако молекулата е малка и свободна в разтвора, ротационното му движение е бързо и излъчената светлина става деполяризирана.

Поляризацията на флуоресценцията се определя количествено от стойността на поляризацията (P), която се определя като разликата между интензитетите на вертикално и хоризонтално поляризирани компоненти на излъчената светлина, разделена на тяхната сума:

[P = \ frac {i _ {\ паралелно} -i _ {\ perp}} {i _ {\ паралелно}+i _ {\ perp}}]

където (i _ {\ паралелно}) е интензивността на вертикално поляризираната излъчвана светлина и (i _ {\ perp}) е интензивността на хоризонтално поляризираната излъчена светлина.

Инструментация за измерване на флуоресцентната поляризация

За да измервате флуоресцентната поляризация, се нуждаете от флуоресцентен детектор, оборудван с поляризационна оптика. Нашата компания предлага редица висококачествени флуоресцентни детектори, включителноИзотермичен флуоресцентен детекториЦифров изотермичен флуоресцентна детектор, които са специално проектирани за точни и чувствителни FP измервания.

Тези детектори обикновено се състоят от следните компоненти:

1. Източник на светлина: Използва се източник на светлина, като ксенонова лампа или лазер, за генериране на светлината на възбуждане. Светлината трябва да бъде поляризирана, преди да достигне пробата.
2. Поляризатори: Поляризаторите се използват за контрол на поляризацията на светлината на възбуждането и емисиите. Поляризаторът на възбуждане се поставя в пътя на светлината на възбуждане, за да се гарантира, че той е линейно поляризиран. Поляризаторът на емисиите се поставя пред детектора за измерване на вертикално и хоризонтално поляризирани компоненти на излъчената светлина.
3. Притежател на пробата: Държачът за проба се използва за задържане на пробата в пътя на светлината на възбуждане. Той трябва да бъде проектиран така, че да сведе до минимум разсейването на светлината и флуоресценцията на фона.
4. Детектор: Фотодетектор, като фотоумноглава тръба (PMT) или устройство, свързано с заряд (CCD), се използва за измерване на интензивността на излъчената светлина. Детекторът трябва да може да измерва интензитетите на вертикално и хоризонтално поляризираните компоненти поотделно.

Експериментална настройка за измервания на поляризация на флуоресценция

Следните стъпки са включени в създаването на експеримент за измерване на флуоресцентната поляризация:

1. Изберете подходящата флуоресцентна сонда: Изберете флуоресцентна сонда, която е подходяща за вашето приложение. Сондата трябва да има висок квантов добив и дълъг живот на флуоресценция.
2. Подгответе пробата: Пригответе пробата чрез разтваряне на флуоресцентната сонда в подходящ буфер. Ако изучавате свързващо взаимодействие, добавете лиганда или макромолекулата към пробата при подходяща концентрация.
3. Калибрирайте инструмента: Калибрирайте флуоресцентния детектор според инструкциите на производителя. Това може да включва регулиране на усилването на детектора, определяне на дължината на вълната на възбуждане и емисии и измерване на фоновата флуоресценция.
4. Измерете стойностите на поляризацията: Поставете пробата в държача на пробата и измерете интензитетите на вертикално и хоризонтално поляризираните компоненти на излъчената светлина. Изчислете стойността на поляризацията, като използвате спомената по -горе формула.

Фактори, влияещи върху измерванията на флуоресцентната поляризация

Няколко фактора могат да повлияят на точността и надеждността на измерванията на поляризацията на флуоресценцията:

1. Температура: Ротационното движение на флуоресцентната молекула зависи от температурата. Увеличаването на температурата води до увеличаване на ротационното движение и намаляване на стойността на поляризацията. Ето защо е важно да се поддържа постоянна температура по време на измерването.
2. Вискозитет на разтворителя: Вискозитетът на разтворителя влияе върху въртящото движение на флуоресцентната молекула. По -вискозният разтворител ограничава ротационното движение и увеличава стойността на поляризацията.
3. Концентрация на флуоресцентната сонда: Концентрацията на флуоресцентната сонда може да повлияе на стойността на поляризацията. При високи концентрации може да се появи самостоятелно гасене и агрегиране на сондата, което води до неточни измервания.
4. Фотоблем: PhotoBreeChing е необратимото унищожаване на флуоресцентната молекула от светлината на възбуждане. Това може да доведе до намаляване на интензитета на флуоресценция и да повлияе на измерването на поляризацията. За да сведете до минимум фотойширането, използвайте ниска интензивна светлина за възбуждане и кратко време на експозиция.

Приложения на флуоресцентна поляризация

Флуоресцентната поляризация има широк спектър от приложения в различни области:

1. Откриване на наркотици: FP се използва за изследване на свързващите взаимодействия между лекарствата и техните цели. Чрез измерване на стойността на поляризацията можете да определите афинитета на свързване и константата на дисоциация на лекарството - целевия комплекс.
2. Имуноанализи: FP - имуноанализи на базата на FP се използват за откриване на наличието на антигени или антитела в биологични проби. Свързването на антигена с антитялото - белязана с флуоресцентна сонда, води до промяна в стойността на поляризацията, която може да се използва за количествено определяне на аналита.
3. Анализ на нуклеинова киселина: FP може да се използва за изследване на хибридизацията на нуклеинови киселини. Свързването на флуоресцентно белязан олигонуклеотид с неговата допълваща последователност води до промяна в стойността на поляризацията, която може да се използва за откриване и количествено определяне на целевата нуклеинова киселина.

Отстраняване на неизправности в измерванията на поляризацията на флуоресценция

Ако срещнете проблеми по време на измерване на поляризацията на флуоресценция, следните съвети за отстраняване на проблеми могат да бъдат полезни:

1. Ниски стойности на поляризация: Ако стойностите на поляризацията са по -ниски от очакваното, проверете за фактори като висока температура, нисък вискозитет на разтворителя или високата концентрация на флуоресцентната сонда.
2. Висока флуоресценция на фона: Високата флуоресценция на фона може да бъде причинена от примеси в пробата или разтворителя или от разсейването на светлината. Пречистете пробата и използвайте чист разтворител. Уверете се, че държачът на пробата е чист и без драскотини.
3. Несъответстващи измервания: Несъответстващите измервания могат да се дължат на фотобелене, лошо подравняване на поляризаторите или колебанията в източника на светлина. Минимизирайте фотойширането, проверете подравняването на поляризаторите и се уверете, че източникът на светлина е стабилен.

Заключение

Измерването на флуоресцентната поляризация е ценна техника за изследване на свързващите взаимодействия и молекулярната динамика на флуоресцентните молекули. Като доставчик на флуоресцентен детектор, ние се ангажираме да осигурим висококачествена инструментация и техническа поддръжка, за да ви помогнем да постигнете точни и надеждни измервания на FP. Независимо дали работите в откриване на лекарства, имуноанализи или анализ на нуклеиновата киселина, нашитеИзотермичен флуоресцентен детекториЦифров изотермичен флуоресцентна детекторможе да отговори на вашите нужди.

Ако се интересувате от закупуване на нашите флуоресцентни детектори или имате въпроси относно измерванията на поляризацията на флуоресценция, моля, свържете се с нас за подробна консултация и договаряне на поръчки. Екипът ни от експерти е готов да ви помогне да изберете най -подходящия инструмент за вашето приложение.

ЛИТЕРАТУРА

1. Lakowicz, JR (2006). Принципи на флуоресцентна спектроскопия. Springer Science & Business Media.
2. Szollosi, J., & Damjanovich, S. (2004). Флуоресцентна поляризация: Практическо ръководство. В текущите протоколи в цитометрията (стр. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.